Applications of Nuclear Magnetic Resonance in metabolomic studies of biological process

A RMN é uma das principais técnicas usadas no estudo de perfis metabólicos pois é uma técnica quantitativa, altamente reprodutível e não-seletiva. Desta forma, o objetivo desta tese foi a aplicação da RMN no estudo metabólico em diferentes processos biológicos. A primeira aplicação foi na análise do perfil metabolômico e metabonômico dos agentes causadores da leishmaniose. Para tal, foram analisados extratos celulares das espécies Leishmania major e Leishmania donovani e extratos destas espécies crescidas com os fármacos miltefosina e paromomicina. Os espectros de RMN de 1H foram analisados pelo programa ChenoMX e os espectros de RMN 2D pelo software TopSpin e as bases de dados HMDB e BMRB. Cerca de 50 metabólitos foram identificados, como a adenina, arginina, glutamina, glutamato, manose, isoleucina, leucina e tirosina. Técnicas quimiométricas como PCA, PLS-DA e heatmaps foram utilizadas para investigar os metabólitos responsáveis pela diferenciação das duas espécies bem como entre as culturas com e sem fármacos. O segundo estudo foi com o composto metilglioxal. A presença de metilglioxal em queijos contribui com o escurecimento e deterioração do sabor, mesmo em baixas temperaturas. Por esta razão, foram estudados os produtos da adição de metilglioxal em extrato de queijo parmesão e o comportamento de diferentes espécies de lactobacilos na presença e na ausência de metilglioxal em extrato de queijo parmesão. Os resultados permitiram um entendimento maior das reações envolvidas entre esta molécula e os componentes do queijo, o que ajudará encontrar alternativas para a resolução do problema e aumentar o tempo de prateleira do queijo. O terceiro estudo realizado foi sobre a produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica. O objetivo deste estudo foi modificar geneticamente uma espécie de lactobacilo para a produção de etanol e analisar a vinhaça de planta de etanol pós-fermentação com levedura. Os espectros de RMN de 1H e 1H-13C mostraram que as bactérias modificadas são eficientes na produção de etanol e que dois açucares foram erroneamente identificados por cromatografia como maltose e maltotriose quando na verdade eram trealose e arabinose.  Por meio destes destes estudos mostrou-se parte das inúmeras aplicações que a RMN tem na metabolômica e que existem diversas ferramentas estatísticas disponíveis para auxiliar no estudo metabolômico.NMR is one of the main techniques used in metabolic profile studies because it is a quantitative, highly reproducible and non-selective technique. Thus, the aim of this thesis was the application of NMR in metabolic studies of different biological processes. The first application was the analysis of the metabolomic and metabonomic profile of the causative agents of leishmaniasis. Cell extracts of the species Leishmania major and Leishmania donovani and extracts of these species grown with miltefosine and paromomycin drugs were analyzed. 1H spectra were analyzed by ChenoMX software and 2D spectra by TopSpin software and HMDB and BMRB databases. About 50 metabolites were identified, such as adenine, arginine, glutamine, glutamate, mannose, isoleucine, leucine and tyrosine. Chemometric techniques were used to investigate the metabolites responsible for the differentiation of the two species and between cultures with and without drugs. The second study was with methylglyoxal molecule. The presence of methylglyoxal in cheese contributes to browning and deterioration of flavor, even at low temperatures. For this reason, products of the addition of methylglyoxal in Parmesan cheese extract and the behavior of different species of lactobacilli in the presence and absence of methylglyoxal in Parmesan cheese extract were studied. The results allowed a better understanding of the reactions involved between this molecule and the components of the cheese, which will help find alternatives to solve the problem and increase the shelf life of the cheese. The third study was about the production of ethanol from lignocellulosic biomass. The objective of this study was to genetically modify a lactobacillus species to produce ethanol and analyze the post-fermentation thin stillage. NMR spectra showed that the modified bacteria are efficient in production of ethanol and that two sugars were erroneously being identified by chromatography as maltose and maltotriose when they actually were trehalose and arabinose. These studies showed part of the numerous applications that NMR has in metabolomics and that there are several statistical tools available to assist in metabolomic studies

Use of time domain NMR relaxometry to study paramagnetic ions in solution

O estudo de soluções iônicas tem grande importância na química analítica. Na RMN, vários pesquisadores se dedicam ao entendimento do papel de íons paramagnéticos nos tempos de relaxação longitudinal (T1) e transversal (T2). A maioria dos trabalhos nesta área se dedicou ao estudo destas influências no T1, que é uma medida bem mais lenta do que a de T2. Assim, neste trabalho se estudou as implicações da relaxometria de T2 por RMN no domínio do tempo (RMN-DT) em soluções de íons paramagnéticos. A partir deste estudo, demonstrou-se a correlação linear entre a taxa de relaxação transversal (1/T2) e a concentração dos íons paramagnéticos. Com isso, usou-se esta metodologia na determinação de constantes do produto de solubilidade (Kps) dos hidróxidos Fe(OH)3, Cu(OH)2 e Mn(OH)2. A determinação da constante de solubilidade (Kps) tem grande importância e aplicação em química, principalmente na separação de íons por precipitação. Foi possível determinar com grande precisão o Kps destes hidróxidos utilizando a metodologia proposta, o que é promissor e encorajador para trabalhos futuros. Estudou-se também a eletrodeposição dos íons Fe3+, Cu2+ e Mn2+ in situ com a RMN-DT. A eletrodeposição tem número considerável de aplicações, tanto na pesquisa, quanto na indústria. E a possibilidade de se monitorar a retirada de íons metálicos sem que esta tenha de ser parada e, além disto, não precisando controlar a viscosidade da solução ou adicionar indicadores químicos é muito interessante. Para este estudo in situ, foram construídas e testadas duas células eletroquímicas, realizadas voltametrias cíclicas para estudo prévio e, finalmente, a eletrodeposição in situ da das soluções. O melhor resultado obtido foi para o Fe3+, seguido do Cu2+, não sendo possível observar a eletrodeposição do Mn2+.The study of ionic solutions is of great importance to analytical chemistry. In NMR, a significant number of researchers devote themselves to the understanding of the role that paramagnetic ions have on longitudinal (T1) and transverse (T2) relaxation times. However, most of the papers published until today have studied this influences on T1, which is whatsoever more complicated to measure than T2. Therefore, we applied we applied the time domain NMR (TD-NMR) transverse relaxometry to study paramagnetic ions in aqueous solutions. The first application was the determination of the Fe(OH)3, Cu(OH)2 and Mn(OH)2 solubility product constants (Ksp). The knowledge of these constants is of industrial and academic interest. Moreover, Ksp is studied as a direct consequence of chemical equilibrium, which prejudices the acquisition of a deeper understanding to the problematic. Thus, use of TD-NMR to study Ksp is a new approach to the already done, with great teaching potential. It was possible to almost precisely determine the Ksp hydroxide values through the proposed methodology, which is promising and encouraging to future studies. It was also explored Fe3+, Cu2+ and Mn2+ electrochemical-NMR in situ experiments. Electrodeposition has a considerable number of applications in research as in industry. And the possibility to monitor the withdrawn of paramagnetic ions from the solution without ceasing the reaction and without the worry of solution viscosity or the need to add chemical indicator is really interesting. To the in situ study two electrochemical cells were built and tested, cyclic voltammetry and amperometric deposition were made. The best result was for iron, followed by copper. Manganese electrodeposition wasn\'t observed

Measuring the solubility product constant of paramagnetic cations using time-domain nuclear magnetic resonance relaxometry

The use of time-domain NMR relaxometry is already well established for determining the concentration of paramagnetic cations. Paramagnetic cations have unpaired electrons, and in aqueous solutions, they interact with hydrogen nuclei, changing the relaxation time of the solvent. Thus, a linear relationship can be established between the nuclear spin-lattice relaxation time, T-1, or the spin-spin relaxation time, T-2, and the concentration of paramagnetic ions in solution. Previous studies have shown the efficacy of using T-1 and T-2 for easily determining the titration equivalence point. Currently, the most practical method for determining T-2 is the Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulse sequence. Thus, in this paper, we used the T-2 relaxation time to determine the concentration of paramagnetic ions in solution. We used T-2 relaxometry as a simple and useful method for measuring the hydroxide solubility products (K-sp) of Fe(OH)(3), Cu(OH)(2) and Mn(OH)(2) aqueous solutions as functions of pH. To our knowledge, this is the first use of T-2 relaxometry to measure K-sp. (C) 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

NMR-based identification of metabolites in polar and non-polar extracts of avian liver

Metabolites present in liver provide important clues regarding the physiological state of an organism. The aim of this work was to evaluate a protocol for high-throughput NMR-based analysis of polar and non-polar metabolites from a small quantity of liver tissue. We extracted the tissue with a methanol/chloroform/water mixture and isolated the polar metabolites from the methanol/water layer and the non-polar metabolites from the chloroform layer. Following drying, we re-solubilized the fractions for analysis with a 600 MHz NMR spectrometer equipped with a 1.7 mm cryogenic probe. In order to evaluate the feasibility of this protocol for metabolomics studies, we analyzed the metabolic profile of livers from house sparrow (Passer domesticus) nestlings raised on two different diets: livers from 10 nestlings raised on a high protein diet (HP) for 4 d and livers from 12 nestlings raised on the HP diet for 3 d and then switched to a high carbohydrate diet (HC) for 1 d. The protocol enabled the detection of 52 polar and nine non-polar metabolites in 1H NMR spectra of the extracts. We analyzed the lipophilic metabolites by one-way ANOVA to assess statistically significant concentration differences between the two groups. The results of our studies demonstrate that the protocol described here can be exploited for high-throughput screening of small quantities of liver tissue (approx. 100 mg wet mass) obtainable from small animals.Fil: Fathi, Fariba. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Brun, Antonio. University of Wisconsin; Estados Unidos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Rott, Katherine H.. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Cobra, Paulo Falco. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Tonelli, Marco. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Eghbalnia, Hamid R.. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Caviedes Vidal, Enrique Juan Raul. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - San Luis. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Ciencias Físico Matemáticas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas de San Luis; ArgentinaFil: Karasov, William. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Markley, John L.. University of Wisconsin; Estados Unido